作者：彭锋 王勇 王河川 陈君 冯文宇 何兵
【摘要】 目的建立泸州山银花中绿原酸和总绿原酸的含量测定方法。 方法采用高效液相色谱（HPLC）法测定绿原酸，并采用UV法测定总绿原酸。色谱柱为Dikma Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.4％磷酸溶液（12∶88）；流速0.8 ml・min-1；检测波长326 nm；柱温30℃；进样量10 μl。 结果绿原酸在0.16～1.6 μg范围内具有良好的线性关系（r＝0.999 9），平均回收率为98.75％，RSD为0.29％。 结论该方法操作简便、快速、有效、灵敏、准确、具有良好的重复性和回收率，可作为山银花中绿原酸和总绿原酸的含量测定方法。
【关键词】 高效液相色谱 山银花 总绿原酸 高效液相色谱
Abstract：ObjectiveTo establish the method for content determination of Chlorogenic Acid and total Chlorogenic Acid in Flos Lonicerae. MethodsThe content of chlorogenic acid was detected by HPLC，and total chlorogenic acid was detected by UV. The separation was carried out on a Dikma Kromasil C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm）．The mobile phase was acetonitrile-0.4% phosphoric acid，the flow rate was 0.8 ml・min-1，the detection wavelength was set at 326 nm，the column temperature was 30℃ and the sample size was 10 μl．ResultsThe calibration curve showed good linearity over the range of 0.16～1.6 μg（r＝0.999 9）. The average recovery was 98.75％ with RSD was 0.29％.ConclusionThis method is simple，rapid，efficient，sensitive，accurate and with good repeatability and recovery，it can be used as a quantitative analysis method for this preparation．
Key words:Flos Lonicerae； Chlorogenic acid； Total chlorogenic acid； HPLC
山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.，红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.或华南忍冬Lonicera confuse DC.的干燥花蕾或带初开的花，具有抗菌消炎、清热解毒、凉散风热的功效，主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等疾病〔1〕。其主要有效成分为有机酸类（绿原酸和异绿原酸）。绿原酸含量高低是山银花内在质量的标志，与药用价值和临床疗效密切相关。山银花分布广泛，而产地不同，绿原酸的含量存在着较大的差异〔2~3〕。四川泸州山银花作为川银花的一个重要来源，其绿原酸含量测定尚未见报道。为全面了解本地区山银花绿原酸的变化及差异，我们采用HPLC首次对泸州四县不同产区采摘的山银花中所含的绿原酸和总绿原酸进行了含量测定，为开发利用本地区的山银花提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器戴安高效液相色谱仪（P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站）；瑞士Precisa电子天平（XR 205SM-DR）；CQX25-06超声波清洗器（上海必能信超声有限公司，功率250 W，频率25 kHz）。
1.2 对照品绿原酸（110753-200412），中国药品生物制品检定所提供。在选定色谱条件分离后按面积归一化法计算含量为98.38%，符合含量限度要求，故以含量为100%计算。
1.3 试药甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
1.4 样品山银花，10批，分别收购于泸州纳溪、叙永、合江和古蔺，经作者鉴定均为灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.。
2 方法与结果
2.1 绿原酸的含量测定
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Dikma Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4％磷酸溶液（12∶88），流速0.8 ml/min，柱温30℃，检测波长326 nm。
2.1.2 对照品溶液的制备 取经五氧化二磷减压干燥至恒重的绿原酸对照品4.0 mg，精密称定，置50 ml棕色量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升含绿原酸80 μg）。
2.1.3 供试品溶液的制备 取山银花适量，50℃烘约5 h，粉碎为细粉（过4号筛）。取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50 ml，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密取续滤液5 ml，置25 ml棕色量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.4 系统适应性实验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1。从图1中可见，绿原酸的保留时间约为10 min，绿原酸峰与其前后色谱峰的分离度分别为12.60，3.34，均大于1.5，拖尾因子为1.03，理论塔板数以绿原酸峰计为15 417，绿原酸峰纯度因子为1 000。
图1 山银花HPLC色谱图（略）
2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取绿原酸对照品溶液（80 μg・ml-1）2，4，6，8，10，15，20 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积A对进样量C（μg）进行回归，得标准曲线方程：A＝34.815 2C + 0.268 5，r＝0.999 9。结果表明，绿原酸在0.16～1.6 μg范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。